Afinite kromatografisi

Afinite kromatografisi a, kromatografik ayırma işlemi çeşitli maddelerin bir çözeltisinden bir analiti izole etmek. Ön koşul, ilgilenilen analit (protein) için uygun bir ligandın (bağlanma ortağı) mevcut olmasıdır. En güçlü ayırma yöntemlerinden biridir . Bununla birlikte, kullanılan kolonlar nispeten pahalıdır, bu nedenle yöntem yalnızca özel durumlarda veya küçük ölçekte (laboratuvar ölçeği) kullanılır.

prensip

Kolon kromatografısi
Toplu kromatografi

Ayırma genellikle sütunlarda gerçekleşir, ancak toplu işlem olarak da gerçekleştirilebilir. Bu yöntemin temizleme etkisi, bir proteinin bir antikor tarafından spesifik olarak tanınmasına veya enzimler söz konusu olduğunda , bir enzimin bir inhibitör , substrat veya kofaktör için spesifik afinitesinin kullanımına dayanır .

Hareketsiz faz , genellikle bir jel , örneğin, B. dekstranlardan veya çapraz bağlı agarozdan (ticari adı Sepharose ), saflaştırılacak analiti spesifik olarak bağlayan uygun bir ligand (z. B. antikoru ) ile birleştirilir. Uygulamada, elüsyonu zorlaştıracağından, analit için afinitenin çok yüksek olmamasına dikkat edilmelidir . Tersine, belirli immünoglobulin sınıflarını bağlayan bir proteine ​​(genellikle protein A , G veya L) sahip sabit bir faz, antikorların (immünoglobulinler) preparatif saflaştırılması için de kullanılabilir .

Bir ligandı taşıyıcı malzemeye bağlamak için, önceden aktive edilmiş bir forma dönüştürülür. Agaroz örneğinde, kovalent bir bağ oluşturmak için analitin amino grupları ile reaksiyona giren reaktif imidokarbonat gruplarının oluşturulduğu siyanojen bromür aktivasyon yöntemi dikkate alınır. Düşük moleküler ağırlıklı bir ligand matris üzerine sabitlendikten sonra (örn. Aktive agaroz), analit büyük bir molekül boyutuna sahipse sterik engeller oluşabilir. Bu durumda ligand, bir köprü elemanı (ayırıcı) aracılığıyla matrise bağlanabilir. Kısa hidrokarbon zincirleri normalde aralayıcı olarak kullanılır ve bunlar daha sonra bir dereceye kadar matris yüzeyinden dışarı taşar.

Denge sabitinden türetilen birleşme sabiti, ligand ve hedef proteinin bağlanması için önemlidir. Bu ne kadar büyükse, afinite kromatografik ayırma o kadar elverişlidir. Değer en az K Ass  = 10 4  mol −1 olmalıdır .

uygulama

Afinite kromatografisi, öncelikle bir tampon çözeltisindeki bir karışımdan bir maddeyi saflaştırmak ve konsantre etmek veya bir karışımdaki bir madde miktarını azaltmak için kullanılır. Afinite kromatografisi sıklıkla hangi biyolojik bileşiklerin belirli bir maddeye bağlandığını belirlemek veya bir enzim çözeltisini saflaştırmak ve konsantre etmek için kullanılır.

icra

Afinite kromatografik çalışma yürütmek için günümüzde biyouyumlu HPLC sistemleri çoğunlukla kullanılmaktadır, ancak burada sadece 150 bara kadar daha düşük basınçlarda çalıştırılmaktadır. Sözde FPLC sistemleri (İngilizce hızlı protein sıvı kromatografisi için ), önemli ölçüde daha düşük, genellikle 10 bar'ın altındaki basınçlarda bile çalışır. Ayrılacak karışım genellikle kolona numune ilmekleri veya numune pompaları aracılığıyla uygulanır ve ilgilenilen madde ligandlar tarafından bağlanır. Diğer tüm maddeler, ligand ile güçlü bir etkileşime girmedikleri için sütunu hızlı bir şekilde terk eder. Spesifik olmayan bağlanmış safsızlıkları gidermek için bir yıkama adımından sonra, liganda bağlanan analit de koşulları değiştirerek ( tampon bileşimi ) kolondan ( elüsyon ) ayrılmasına neden olur . Elüent olarak genellikle bir asidik tampon veya bir çözücü / su karışımı kullanılır. Alternatif olarak, hedef protein veya fazla miktarda serbest ligand ile rekabet halinde hareket eden maddeler de eklenebilir. Eluat saflaştırılmış ve zenginleştirilmiş analiti ihtiva etmektedir. Toplu işlem, yukarıda açıklanan sütun işlemi prosedürüne çok benzer. Bununla birlikte, önemli bir fark, basınçtan bağımsız olan santrifüj ve diğer ayırma yöntemlerinin kullanılmasıdır. Gereksinimlere bağlı olarak, iki işlem, sütun işleminin toplu işlemi takip ettiği birbiriyle birleştirilebilir.

Daha yeni gelişmeler, seri olarak bağlanmış birkaç sütun kullanımına dayanmaktadır. Burada, pahalı ligandlar maksimum doluluk oranına kadar kullanılabilir. Bu, tek sütunlu işlemlerde mümkün değildir, çünkü ürünün bir kısmı artık bağlı değildir ve bu nedenle ayrıştırılır ve kaybolur. Çok sütunlu işlemlerde, bu elüat başka bir sütunda toplanır. Sütunların dönüşümlü olarak yüklenmesi ve ayrıştırılmasıyla, genellikle sürekli kromatografi olarak adlandırılan periyodik bir işlem elde edilir. Bu, iki sütun ile verimli bir şekilde uygulanabilir; daha fazla sütun, verimliliği düşürür.

Özel prosedürler

Afinite kromatografisinin nükleik asitlerin, proteinlerin veya kanın saflaştırılmasında özel kullanımları vardır. Örnekler şunları içerir: His-Tag veya Strep Etiketleme- Rekombinant proteinlerin saflaştırılması için:

1. Bağışıklık afinitesi: Antikorların kan serumlarından saflaştırılması
2. Hareketsizleştirilmiş metal iyon afinite kromatografisi (IMAC): Amino asitlerin, özellikle histidinin metallere kovalent bağlanmasına dayanır
3. Rekombinant Proteinler
4. Lektinler : Örnekteki maddeleri ayırmak için karbonhidratları bağlayan proteinler.

Örnekler

Protein saflaştırması için ligand örnekleri:

Ligand Hedef protein
Antijen ,
Protein A , Protein G veya Protein L. 		antikor
Substrat , kofaktör enzim
Ligand reseptör
Ders anlatımı Glikoprotein
nükleik asit Nükleik asit bağlayıcı protein
Streptavidin , avidin Biyotin ,
protein streptavidin peptidin
Ni 2+ - NTA
gibi metal iyon şelat 		Poli- Protein histidin peptidi

Edebiyat

  • Heinz Bende: Afinite Kromatografisi . İçinde: Zamanımızda Kimya . bant 8 , hayır. 1 , 1974, s. 17-25 , doi : 10.1002 / ciuz.19740080104 .
  • Jerker Porath vd. (1975): Metal şelat afinite kromatografisi, protein fraksiyonasyonuna yeni bir yaklaşım. İçinde: Doğa. Cilt 258, No. 5536, sayfa 598-599. PMID 1678

Ayrıca bakınız

Bireysel kanıt

  1. ↑ Daniel Baur, Monica Angarita, Thomas Müller-Späth, Fabian Steinebach, Massimo Morbidelli: Optimum tasarım ile kesikli ve sürekli çok kolonlu protein A yakalama işlemlerinin karşılaştırılması . İçinde: Biyoteknoloji Dergisi . bant 11 , hayır. 7 , 1 Temmuz 2016, s. 920-931 , doi : 10.1002 / biot.201500481 .
  2. ↑ Thomas GM Schmidt, Arne Skerra: Tek adımlı saflaştırma ve proteinlerin yüksek afinite tespiti veya yakalanması için Strep-tag sistemi . İçinde: Doğa Protokolleri . bant 2 , hayır. 6 , p. 1528-1535 , doi : 10.1038 / nprot.2007.209 .
  3. ↑ Hareketsizleştirilmiş Lectin. gelifesciences.com, GE Healthcare Lifesciences

İnternet linkleri