Aşırı ifade

Aşırı ekspresyon , bir hücredeki bir genin büyük ölçüde artan ekspresyonu olarak tanımlandığında . Bir buna uygun olarak artırılmalıdır Bu sonuçlar sentezi protein olan kodlanmış bundan geni .

Bir viral enfeksiyon sırasında doğal aşırı ekspresyon meydana gelebilir , tümörlerde hatalı gen regülasyonundan kaynaklanabilir veya laboratuvarda bir ekspresyon vektörü yardımıyla bir rekombinant protein üretmek için yapay olarak indüklenebilir .

Hedeflenen aşırı ifade uygulamaları

Bir rekombinant protein üretmek için aşırı ekspresyonun kullanılabileceği iki alan vardır:

  • Proteinin daha sonra saflaştırılması ve daha fazla kullanılması için aşırı ekspresyonu (burada, araştırma amacıyla küçük miktarlarda protein üretmeyi amaçlayan ekonomik süreçler ve süreçler arasında yine de ayrım yapabilirsiniz)
  • Proteini ve özelliklerini ve üretim organizması üzerindeki etkisini analiz etmek için aşırı ekspresyon

Analitik aşırı ifade durumunda, sürecin ekonomik verimliliğine daha az vurgu yapılır. Üretimin optimizasyonu yoktur, ancak bir kural olarak, piyasada bulunan denenmiş ve test edilmiş standart sistemler kullanılır. Lüks, yani H. Miktarın artırılması sağlanmamaktadır.

Üretim süreçlerini oluştururken, mümkün olan en kararlı ve üretken süreci elde etmek için genellikle aşırı ifadenin kapsamlı optimizasyonu vardır. Mümkün olan en büyük ürün miktarını elde etmek için genetik ve süreç düzeyinde çeşitli parametreler çeşitlidir.

Prokaryotlar

Prokaryotlarda proteinin aşırı ekspresyonunun en yaygın biçimi , plazmid vektörlerinin kullanılmasıdır . Burada bir ekspresyon kaseti, bir plazmit (lokalizasyon) üzerine yerleştirilir, organizmaya dönüştürülür ve burada yetiştirme süresi boyunca stabilize edilir. Bu yöntemin avantajı, genetik olarak basit çalışma şekli ve plazmid kopya sayısı ile elde edilen yüksek gen dozunda yatmaktadır.

Prokaryotlarda aşırı ekspresyonun bir başka yöntemi, aşırı ekspresyon kasetlerinin genomik olarak dahil edilmesidir. Aşırı ekspresyon için, muhtemelen RNA-stabilize edici modifikasyonlarla kombine edilmiş güçlü bir promoter sistemi seçilmeli veya kasetin genoma çoklu entegrasyonu yoluyla yüksek bir gen dozu elde edilmelidir.

Faj genomlarında aşırı ekspresyon için genlerin lokalize edilmesi de mümkündür. Ekspresyon sistemi daha sonra genetiği değiştirilmiş fajlarla enfekte edilir. Fajlar, bakterinin metabolizmasını ele geçirdiğinde, hedef gen de büyük ölçüde ifade edilir.

Ökaryotlar

Genler ayrıca ökaryotlarda aşırı ifade edilir . Bu, hücre kültüründe veya tüm organizmada yapılabilir. Tüm organizmada aşırı ekspresyon için geçici veya genoma entegre ekspresyon kasetleri kullanılır. Şöyle promoterler arasında olması , CMV promoteri ve CAG promotörü kullanılır. Plazmidler ayrıca hücre kültüründe ekspresyon için kullanılır. Bu işlemde, bakterilerde üretilen ve ilgili ekspresyon kasetini içeren büyük miktarlarda plazmid DNA hücreye sokulur . Bununla birlikte, plazmitler ökaryotik hücrelerde çoğalamaz ve bu nedenle bir süre sonra kaybolur. Bu yöntem, genellikle bir hücre üzerindeki aşırı sentezlenmenin etkisini karakterize etmek için araştırma amacıyla kullanılır. Üretim suşları genellikle kasetin genomik entegrasyonu yoluyla oluşturulur.

Hücresiz ifade

Hücresiz protein sentezi , plazmid ya da hücre lizatlarının hazırlanmasına dayanmaktadır mRNA vardır (karıştırılmış ve daha sonra, hücre içermeyen bir in vitro kodlanmış hedef proteini üretmek için). Bu yöntem hala nispeten verimsizdir. Oldukça zehirli ürünlerin imalatı için uygundur.

Farklı ifade türleri

Aşırı ifade ile temelde iki ifade yolu vardır:

  • sürekli ifade
  • uyarılmış ifade

Sürekli ifade ile, gen sürekli olarak bir kurucu destekleyici yoluyla ifade edilir ve karşılık gelen protein hücrede birikir.

İndüklenen ekspresyonda indüklenebilir bir promotör kullanılır. Hedef genin ekspresyonu, bir indükleyici tarafından indüklenir, yani aktive edilir. Bu yöntem, aşırı ifadenin üretim organizması üzerinde olumsuz etkilere sahip olması durumunda sıklıkla kullanılır. Bunun nedenleri, büyüme aşamasında metabolik kaynaklar üzerindeki yüksek yük olabilir. Sonuç, daha yavaş büyüme ve dolayısıyla biyoreaktörün daha uzun çalışma süreleri ve dolayısıyla özellikle endüstriyel işlemlerde üretim maliyetlerinde bir artıştır. Hücreler için toksik olan ürünlerde indüklenmiş ekspresyon da avantajlıdır. Burada ifade indüksiyonundan sonra hücrenin kendi kendine zehirlenmesi ve ölümü meydana gelir. Bir üretim sürecinin karlılığıyla ilgili olarak, bu nedenle süreci bir büyüme aşamasına ve bir üretim aşamasına bölmek için girişimlerde bulunulur. Mümkün olan en büyük biyokütle miktarı, büyüme aşamasında üretilir ve hedef protein daha sonra, destekleyicinin uyarılmasıyla üretim aşamasında üretilir. Bu sayede hücreler ölmeden önce maksimum miktarda ürün elde edilir ve bu da süreci önemli ölçüde daha ekonomik hale getirir.

Yaygın aşırı ifade sistemleri

Rekombinant proteinlerin aşırı ekspresyonu için en sık kullanılan sistem, Gram-negatif bakteri E. coli'dir . Bununla birlikte, Gram-pozitif Bacillus megaterium , Corynebacteria ve maya gibi çeşitli diğer organizmalar da kullanılmaktadır . Ökaryotlarda ekspresyon, çeşitli proteinler için gereklidir, bu nedenle hayvan hücre çizgileri (örn. Sf9 hücreleri, CHO hücreleri , Vero hücreleri veya HEK hücreleri ) gibi çeşitli hücre kültürü çizgileri kullanılır. Bazı proteinler, ilaçlama sırasında bitkiler gibi genetiği değiştirilmiş organizmalarda da üretilir . Keçiler veya sığırlar gibi yüksek ökaryotların bütün organizmaları da daha az sıklıkla kullanılır .

E. coli'de substrat indüksiyonu yoluyla hedeflenen aşırı ekspresyon

Model organizmaların hücrelerinde (örneğin E. coli ) proteinlerin transgenlerin yardımıyla hedeflenen aşırı ekspresyonu, biyolojik ve tıbbi araştırmalarda , işlevini kullanmak veya daha ileri düzeyde kullanmak için daha büyük miktarda (birkaç mg ) bir protein üretme olasılığıdır. deneyler Yapıyı inceleyin . Yaygın bir yöntem, transkripsiyonu bakteriyel lac operon tarafından düzenlenen bir transgenin aşırı ekspresyonudur .

Vektörler

En yaygın olarak, pBR322 plazmitine dayalı vektörler , pUC plazmitleri veya pET vektörleri gibi vektör tasarımı ile kullanılır ve uyarlanır .

indüksiyon

Destekleyicileri indüklemek için en yaygın olarak kullanılan sistem, E. coli lac operonudur . Bir indükleyici olarak laktoz veya IPTG kullanılır. Ancak arabinoz (bkz. PBAD sistemi) veya ramnoz (bkz. E. coli KRX) içeren sistemler de yaygındır. Fiziksel indüksiyon için bir sistem, örneğin, Takara'dan E. coli cspA promotörüne dayanan sıcaklıkla indüklenen soğuk şok promotör sistemidir .

Destekleyiciler

Farklı destekleyicilere sahip ticari sistemlerin seçimi nispeten büyüktür. T7 promotörü veya bla promotörü gibi her iki doğal promotör, aynı zamanda sentetik promotörler ve E. coli genomundan trp ve lac promotörlerinin bir melezi olan tac promoteri gibi hibrit promotörler kullanılır .

Genetik gereksinimler

Transgen, bir plazmid üzerinde bakteriyel genomun dışında bulunur . Gerçek kodlama bölgesi başlamadan önce, yani transgenin yukarı akışında , lac operon ( lacO ) operatörü konumlandırılır. Plazmid ayrıca lac baskılayıcı LacI'i kodlayan lacI genini de içerir . LacI, operatör lacO'yu transgenin önünde bağlar ve onun destekleyicisini bloke eder , böylece transgenin ekspresyonunu ve dolayısıyla kodlanmış proteinin aşırı üretimini önler.

IPTG ile substrat indüksiyonu

Allolaktoza çok benzeyen bir molekül olan IPTG , transgenin önünde operatörde bulunan baskılayıcıyı bağlar. Bu, baskılayıcının yapısını değiştirir, artık DNA'yı bağlayamaz ve operatörü serbest bırakır. Bu, promotörü RNA polimeraz için erişilebilir kılar . Destekleyiciye bağlanmaları, DNA'nın mRNA'ya transkripsiyonunu başlatır .

Aşırı ifade için uygun promotörler

Tek başına transkripsiyonu başlatmak için bir promoterin salınması, çok büyük miktarlarda protein üretmek için yeterli değildir. Bunun için büyük miktarlarda mRNA mevcut olmalıdır, bu da transkripsiyonun çok verimli olması gerektiği anlamına gelir. RNA polimerazlarını hızlı bir şekilde art arda destekleyiciye aktaran ve transkripsiyonun aynı hızda başlamasını sağlayan güçlü hızlandırıcılar gereklidir. Örnekler arasında, aynı isimdeki bakteriyofajdan T7 promotörü veya E. coli genomundan trp ve lac promotörlerinin bir melezi olan tac promotörü yer alır . Bununla birlikte, T7 promotörü için, karşılık gelen T7 RNA polimerazı , ekspresyon sisteminin genomunda da mevcut olmalıdır .

Edebiyat

  • Joseph Sambrook , David W. Russell: Moleküler Klonlama. Bir Laboratuvar Kılavuzu. Cilt 3. 3. baskı. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York NY 2001, ISBN 0-87969-576-5 .

Bireysel kanıt

  1. ↑ Marc Cruts ve diğerleri: Progranülindeki boş mutasyonlar, kromozom 17q21'e bağlı ubikitin pozitif frontotemporal demansa neden olur. İçinde: Doğa. 442, s. 920-924 (24 Ağustos 2006) doi : 10.1038 / nature05017 .
  2. ↑ Ma Y, Ghoshdastider U, Wang J, Ye W, DötschV, Filipek S, Bernhard F, Wang X: İnhibitör taraması için insan Glukozamin 6-fosfat N-asetiltransferazın (HsGNA1) hücresiz ifadesi. . In: Protein Expres Purif . 86, No. 2, 2012, s. 120-126. doi : 10.1016 / j.pep.2012.09.011 . PMID 23036358 .
  3. ^ C.Roos, L. Kai, S. Haberstock, D. Proverbio, U. Ghoshdastider, Y. Ma, S. Filipek, X. Wang, V. Dötsch, F. Bernhard: Yüksek Seviye Hücresiz Membran Üretimi Nanodiskli Proteinler . In: Moleküler Biyolojide Yöntemler . 1118, 2014, s. 109-30. doi : 10.1007 / 978-1-62703-782-2_7 . PMID 24395412 .
  4. ↑ Roos, L Kai, D Proverbio, U Ghoshdastider, S Filipek, V Dötsch, F Bernhard: Hücresiz eksprese edilen membran proteinlerinin sağlanan lipit çift tabakalar ile birlikte translasyonel ilişkisi . In: Moleküler Membran Biyolojisi . 30, No. 1, 2013, s. 75-89. doi : 10.3109 / 09687688.2012.693212 . PMID 22716775 .
  5. ↑ DA Mead, E. Szczesna-Skorupa, B. Kemper: Tek iplikli DNA 'mavi' T7 hızlandırıcı plazmitler: klonlama ve protein mühendisliği için çok yönlü bir ikili hızlandırıcı sistem. İçinde: Protein Mühendisliği. Yıl 1986, No. 1, s. 67-74.
  6. ↑ HA de Boer, LJ Comstock, M. Vasser: tac promoteri: trp ve lac promoterlerinden türetilen fonksiyonel bir hibrit. In: Ulusal Bilimler Akademisi Tutanakları . 80, 1983, s. 21-25.
  7. ^ Sigma-Aldrich tarafından T7 promoter systems web sitesi, 29 Mayıs 2011'de erişildi.