Jel elektroforezi

Deneysel kurulum
SDS-PAGE dikey jel elektroforez cihazı
Agaroz jel elektroforezi için yatay jel elektroforez aparatı

Jel elektroforezi ( eski Yunanca φερειν pherein'den türetilen ikinci kelime: jel | elektro | phoreesis , 'taşıma'), farklı molekül türlerini ayırmak için kimya ve moleküler biyolojide analitik bir yöntemdir .

prensip

Farklı iyon hareketliliği , bir elektrik alanındaki iyonik maddeleri ayırmak için çeşitli elektroforez yöntemlerinde kullanılır ve örn. B. bir ölçümü ayrı ayrı besleyin.

Jel elektroforezinde, ayrılacak elektrik yüklü moleküllerin bir karışımı , bir elektrik alanının etkisi altında, bir iyonik tampon çözeltisi ( elektroforez tamponu ) içinde bulunan bir jel boyunca hareket eder . Moleküllerin boyutuna ve yüküne bağlı olarak, moleküler bir elek görevi gören jel boyunca farklı hızlarda hareket ederler. Küçük, negatif yüklü moleküller ( anyonlar ), en hızlı şekilde pozitif yüklü anot yönünde ve pozitif yüklü moleküller ( katyonlar ), negatif yüklü katot yönünde göç ederler . Temel teoriler, tamamlayıcı Ogston Elek Teorisi ve Reptasyon Teorisidir . Elek teorisi , jel matrisinin tanımlanmış bir gözenekliliği yoluyla küresel makromoleküllerin (örneğin proteinler veya miseller ) tutulmasını tanımlarken, sürünme teorisi, makro moleküllerin jel matris üzerinde küresel olmayan makromoleküllerin sürtünmesi yoluyla tutulmasını ele alır (örneğin, DNA ve RNA ).

Jel matrisi

Jelin polimer molekülleri, elektrik alanında ayrılacak moleküllerin göçünü az ya da çok yavaşlatan, az ya da çok yakın örgülü, üç boyutlu bir kafes oluşturur.

Agaroz

Agaroz jelleri nispeten büyük gözeneklere sahiptir ( yüzde bir için 150 nm , yüzde 0.16 jeller için 500 nm) ve DNA ile yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri ayırmak için çok uygundur . Farklı uzunluktaki DNA bantları arasındaki mesafe, jeldeki agaroz konsantrasyonuna bağlıdır. Daha yüksek konsantrasyonlar daha uzun çalışma süreleri gerektirir (bazen hatta günler). Ancak asıl uygulama alanı nükleik asitlerin ayrıştırılmasıdır. Agaroz jeller, deniz yosunundan elde edilen doğal polisakardi polimerlerinden yapılır . Agaroz jel ile elektroforez fiziksel bir ayardır. Deneyden sonra, sonuç bir plastik torba kullanılarak dondurulmuş olarak saklanabilir.

Poliakrilamid

Ve jeller poliakrilamid cinsindendir polimerizasyon bölgesinin akrilamid üretti. Çok daha küçük gözenekleri vardır (3–6 nm). Gözenek boyutu, akrilamid konsantrasyonuna ve çapraz bağlanma derecesine bağlıdır. Genellikle 5 ile 20.000 kDA arasındaki proteinler bununla ayrılır.

Gücü

Diğer bir olasılık, kısmen hidrolize patates nişastasının% 5 ile% 10 arasındaki konsantrasyonlarda kullanılmasıdır. Denatüre edilmemiş proteinlerin elektroforezi için toksik olmayan bir ortamdır. Ayırma, boyut ve yüke göre gerçekleşir ve görselleştirme, naftol siyahı veya amido siyahı renklendirmesi ile yapılır. İlave edilmeden biyosit , nişasta jeller mikrobik bozma.

icra

Elektroforezden önce jel ceplerinde DNA ve akan boya içeren agaroz jel.

Klasik jel elektroforezi, bölge elektroforezi olarak gerçekleştirilir. Daha yüksek çözünürlüğe ulaşmanın bir yöntemi, toplu elektroforezdir .

Jel elektroforezi ısı üretir . En uygun koşulları sağlamak için bu kaldırılmalıdır. Bu nedenle, jel elektroforezi, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için soğutulmuş ekipmanda sabit sıcaklıklarda gerçekleştirilmelidir.

İdeal olarak elektroforez, en küçük veya en hareketli moleküller jelin sonuna ulaştığında sona erer. Bu, moleküllerin mümkün olan en yüksek düzeyde ayrılmasını garanti eder.

değerlendirme

Özdeş moleküller , halk arasında bantlar olarak bilinen ayrı bölgelerde jelden geçer. Aynı jelden birkaç numune paralel olarak çalışabilir. Bazı moleküllerin boyutu biliniyorsa, diğer moleküllerin boyutları, bantlarını kalan bantlarla karşılaştırarak tahmin edilebilir. Bu tür moleküler kütle standartları ticari olarak mevcuttur. Bir komigrasyon standardı , bilinmeyen bir numune bileşiminin bilinen bir numune bileşimi ile karşılaştırılmasının yardımıyla benzer şekilde çalışır . DNA veya proteinler , moleküler kütle standartları olarak kullanılır.

Bir banttaki bir maddenin miktarının veya bir bandın nispi oranının belirlenmesi (bkz: Miktar belirleme ), jelin renklendirilmesi, fotoğraflanması veya taranması ve ardından çok karanlık olması durumunda kısıtlama ile bir yoğunluk ölçümü değerlendirmesinden sonra mümkündür. bantlar, ışığa maruz kalmadığından Bandın iç alanı sayılamaz. Bir jelin ölçülen değerlerini belirlemek için Değerlendirme yazılımı çoğu durumda, örneğin genişlikler, moleküler kütleler , nicelikler veya normalizasyon kullanılır.

Etidyum bromür ile boyanmış bir agaroz jelde UV ışığı altında DNA bantları.

Elektroforezden sonra jeli değerlendirmek için, ayrılacak moleküller ya elektroforezden önce radyoaktif olarak etiketlenir ve daha sonra bir otoradyografide tespit edilir veya elektroforezden sonra çeşitli boyalarla karıştırılır.

Etidyum bromür genellikle nükleik asitlerle araya giren ve onları UV ışığı altında görünür kılan nükleotid analizinde kullanılır . Proteinler, doğrudan protein boyalarıyla , ör. B. Coomassie parlak mavi ile veya gümüş renginde . Sonraki lekeleme , boyamaya bir alternatiftir . Biri ayırt eder:

Uygulama alanları

Jel elektroforezi, moleküler biyoloji , biyokimya ve gıda analizinde kullanılır. Jeller, çok fazla çaba sarf etmeden kendiniz yapılabilir. Bitmiş jeller ve ilgili tampon sistemleri de ticari olarak satın alınabilir.

Çok sayıda özel uygulama vardır:

Edebiyat

İnternet linkleri

Commons : Jel Elektroforezi  - Görüntü, Video ve Ses Dosyalarının Toplanması

Bireysel kanıt

  1. ↑ Alexander George Ogston : Düzgün bir rastgele lif süspansiyonundaki boşluklar. In: Faraday Derneği İşlemleri. Cilt 54, 1958, ISSN  0014-7672 , sayfa 1754-1757, doi : 10.1039 / TF9585401754 .
  2. ^ Gary W. Slater, Jean Rousseau, Jaan Noolandi, Chantal Turme, Marc Lalande: Agaroz jellerde DNA elektroforezinin üç rejiminin kantitatif analizi. İçinde: Biyopolimerler. Cilt 27, No. 3, 1988, ISSN  0006-3525 , sayfa 509-524, PMID 3359012 , doi : 10.1002 / bip.360270311 .
  3. ↑ Oscar J. Lumpkin, Philippe Déjardin, Bruno H. Zimm: DNA'nın jel elektroforezi teorisi. İçinde: Biyopolimerler. Cilt 24, No. 8, 1985, sayfa 1573-1593, PMID 4041551 , doi : 10.1002 / bip.360240812 .
  4. ↑ Agaroz Jel Elektroforezi. Erişim tarihi: Şubat 18, 2015
  5. ^ Joseph Sambrook, David Russell: Moleküler Klonlama - Bir Laboratuvar Kılavuzu
  6. ↑ Gordon AH: Poliakrilamid ve nişasta jellerinde proteinlerin elektroforezi . American Elsevier Publishing Company, Inc, New York 1975.
  7. ↑ Smithies O .: Nişasta jellerinde zon elektroforezi: normal yetişkinlerin serum proteinlerindeki grup varyasyonları . İçinde: Biochem. J. Band 61 , hayır. 4 , 1955, s. 629-641 , PMID 13276348 , PMC 1215845 (ücretsiz tam metin).