Kapiler Elektroforez

Kapiler elektroforez aparatının şematik yapısı

Kapiler elektroforez (Engl. Kapiler Elektroforez , CE), elektroforeze dayalı analitik ayırma yöntemidir .

Elektroforez, yüklü parçacıkların ( iyonların ) bir (çoğunlukla sıvı) bir ortamda, bir elektrik alanının etkisi altında hareketidir (göçü / taşınması) . Farklı iyonların yer değiştirme hızları, bunların yüküne, şekline ve etkili boyutunun yanı sıra çözüm ortamına ve elektrik alanın gücüne bağlıdır . Bu nedenle, bir elektroforetik göç sırasında farklı iyonlar ayrılır. Bu, hazırlıklı olarak ve her şeyden önce analitik olarak kullanılabilir .

Kapiler elektroforezde, bu ayırma, bir elektrolit çözeltisi içinde ince bir kılcal tüp içinde gerçekleşir . Numune hacimleri 10 nanolitre (0,01 mm³) kadar küçük olabilir. Tipik analiz süreleri 2 ile 10 dakika arasındadır.

Temel bilgiler

Elektroforetik hareketlenme

Elektroforez temelleri tarafından açıklanan elektrik hareket . Mobil yük taşıyıcılarının elektroforetik hareketliliği , elektrik alanındaki göç hızı için belirleyicidir .

Elektro-ozmotik akış

Genellikle elektroforetik yer değiştirmeyle örtüşen elektroozmotik akış ( EOF ), kılcal elektroforez için önemlidir . Gücü , elektrolitin pH'ına ve kılcal yüzeyin yakınındaki yüke bağlıdır . Elektroozmotik akış, bir elektrik alanı uygulandığında iç kapiler duvar ile elektrolit solüsyonu arasındaki arayüz olgusunun bir sonucu olarak meydana gelir.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi kromatografik işlemlerin aksine , kapiler elektroforez, elektroozmotik akış nedeniyle çok düz bir akış profili ile sonuçlanır . Bu, tepe noktalarının daha yüksek keskinliği ile birlikte bantların sadece hafif bir genişlemesine neden olur .

hikaye

İsveçli araştırmacı Arne Tiselius (1902–1971) elektroforezin mucidi olarak kabul edilir . Teknolojiyi analitik ve kimyasal olarak ilk kullanan kişi oldu. 1948'de çalışmaları için Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü . Arne Tiselius tarafından sunulan klasik elektroforez, bir elektrolit solüsyonuyla ıslatılmış jeller veya kağıt şeritler kullanır. Bir zaman elektrik alanı uygulandığında, şarj maddeleri çekilmesiyle ayrıldığı katyonları için katot ve anyonlar için anot , nötr maddeler taşınmaz. Klasik jel veya kağıt elektroforezinin iki ana dezavantajı vardır. Kantitatif bir değerlendirme ancak yansıma ölçümü ile mümkündür. B. Proteinler ancak boyamadan sonra incelenebilir ve bu nedenle hataya çok açıktır. Joule ısısı voltajla birlikte kuadratik olarak arttığından , jelin veya kağıt şeridin kurumasını önlemek için voltaj çok yüksek uygulanmamalıdır . Bununla birlikte, düşük voltajlar çok uzun analiz sürelerine yol açar, bu nedenle 10 cm uzunluğundaki bir jel gerilmesi için analiz süresi birkaç saat olabilir. Algılama ve soğutma problemlerini kontrol altına almak için, yüksek performanslı sıvı kromatografi ve gaz kromatografisinde yaygın olduğu gibi, elektroforetik ayırmanın açık tüplere aktarılması için girişimlerde bulunulmuştur . Bununla birlikte, elektrolitteki konveksiyon akımlarından yeni problemler ortaya çıktı. Açık bir cam tüpteki ilk ayrım, 1967'de Hjertén tarafından tanımlandı.

Kapiler elektroforezin gelişimi

Kılcal elektroforezin asıl gelişimi, 1970'lerin sonlarında Mikkers, Everearts ve Verheggen'in öncü çalışmaları ile başladı. Başarı, 200 ile 500 µm arasında iç çaplara sahip cam ve Teflon'dan yapılmış ince kapiler kullanılarak elde edildi . Ancak günümüzün kapiler elektroforezin yüksek verimli ayırma performansı, yalnızca 1981'de Jorgenson ve Lukacs tarafından, bilinen gaz kromatografisinden kullanılabilir , kaynaşmış silis kapilerleri 50 ila 200 mikrometre iç çapları olan mikronlar elde edilir. Kılcal damarların daha elverişli yüzey / hacim oranı, termal olarak indüklenen konveksiyonun bozucu etkisini büyük ölçüde azalttı ve kuvarsdan yapılan kılcal damarlar , yüksek performanslı sıvı kromatografisinde kullanılanlar gibi dedektörlerin kullanılmasını da sağladı . Son yıllarda, kapiler elektroforez, yüksek performanslı sıvı kromatografisine dikkate değer bir alternatif olarak kendini kanıtlamıştır ve bunun ayırma ilkelerinin çoğu, kapiler elektroforeze aktarılmıştır. Kapiler elektroforez, öncelikle yüksek ayırma verimliliği, otomatikleştirilme kolaylığı ve ayırma koşullarının geniş uyarlanabilirliği nedeniyle analitikte kendini kanıtlamıştır. Son yıllarda, kapiler elektroforez, terapötik proteinlerin analizi için özellikle popüler hale gelmiştir . Tanınmış şirketler bununla monoklonal antikorların kalite kontrolünü gerçekleştirmektedir .

Kapiler elektroforez aparatının yapımı

Elektrolit ile dolu kaplara (şişelere) her iki ucu ile daldırılan elektrolit ile doldurulmuş bir kılcal damar, kapiler elektroforez aparatının ana bileşenini oluşturur. Ayırma işlemi için yüksek voltaj , bu elektrolit kaplar aracılığıyla sağlanır. Çoğu uygulama için, 20–100 cm uzunluğunda, 50–250 µm iç çapa sahip poliimid kaplı erimiş silika kapilerler kullanılır. Poliimid kaplama, kılcal kısımlar o kadar kolay kırılmadığı için daha iyi kullanım sağlar. Yüksek voltaj kaynağı tarafından 30 kV'a kadar voltaj uygulanabilir. Kuvars kılcal damarların kullanılması , UV saptamasını mümkün kılar, ancak kılcal, güçlü renkli poliimid filme yerleştirilmeden önce, algılamanın gerçekleştirildiği bir detektör penceresi çizilmeli veya yakılmalıdır. UV dedektörlerine ek olarak, floresans dedektörleri , endüktif iletkenlik dedektörleri , elektrokimyasal veya radyoaktif dedektörler kullanılabilir. Kapiler elektroforez oluşan bir kombinasyon , kütle spektrometresi , bir (MS) , kılcal elektroforez, kütle spektrometresi , çok küçük olduğundan, teknik çok daha zor, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile daha miktarlarda sıvı Elüe kılcal . Kütle spektrometresi ile bir bağlantı için, akış genellikle bir "kılıf sıvısı" kullanılarak doldurulmalıdır. Teknik olarak daha zorlu bağlantıya rağmen, uçuş zamanı kütle spektrometreleri ile birleştirme, geleneksel dedektörlere göre çok daha yüksek hassasiyetler ve daha iyi türleme olanakları sağlar .

Analiz süreci

Örneği kılcal damar içine sokmak için, kılcal girişteki elektrolit kabı bir numune kabı ile değiştirilir. Numune enjeksiyonunun kendisi birkaç yolla yapılabilir. Bu gerçekleştirilebilir hidrodinamik kılcal giriş basınç uygulayarak veya uygulanarak vakum kılcal çıkışta. Enjekte edilen numune hacmi daha sonra basınç veya vakumun boyutuna ve zamana göre belirlenir.

Numune hidrostatik olarak da uygulanabilir (sifon enjeksiyonu). Bu durumda, girişteki numune kabı 5–20 cm yükseltilir veya kapiler çıkıştaki kap alçaltılır, bu da seviye farkıyla bir hidrostatik akış oluşturur . Bu durumda enjekte edilen numune hacmi, hidrostatik basınç farkı ve süre ile belirlenir. Gerçekte, sadece yaklaşık 10 nl büyüklük sırasındaki numune hacmi belirlenmez, bunun yerine yöntem, aynı koşullar altında enjekte edilen bir standarda göre kalibre edilir .

Diğer bir olasılık, bir voltaj uygulayarak elektrokinetik enjeksiyondur . Esas olarak çok seyreltik numuneler için kullanılır. İyonlar izin toplamak içinde elektrik alanı kılcal girişinde. Ayrıca, bu durumda elektroozmotik akış (EOF, aşağıya bakınız) belirli bir numune hacmini çeker .

Numune uygulandıktan sonra, numune kabı bir elektrolit kabı ile değiştirilir ve elektroforez voltajı uygulanır. Bu, elektroforetik göç ve ayrılmasına neden olan iyonik analitler olarak kılcal olarak elektroozmotik akışı .

Birlikte elektro-ozmotik akış elektrolit ve kılcal damar içinden arasında saklanan örnek tahrik analit iyonları spesifik migrasyon hızı ve dolayısıyla toplama özel bölgelerde uygun elektro-ozmotik akışın veya karşı önde hareket eder. Bu bölgeler algılama penceresinin önünden kılcalın sonuna doğru sürülürse, dedektör bunları birbiri ardına iyona özgü " pikler " olarak kaydeder . Bu detektör reaksiyonları, bir kayıt cihazı veya bir bilgisayar tarafından kaydedilir ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinde olduğu gibi, nispi göç hızlarına göre tanımlanır ve yüzey alanlarına göre kantitatif olarak değerlendirilir.

teknikler

Kapiler elektroforezde, biri kapiler bölge elektroforezi (CZE) olan çok çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Örnek burada mümkün olan en dar bant olarak uygulanır. Elektrik alanını uyguladıktan sonra , numunenin her bir bileşeni hareketliliğine bağlı olarak hareket eder, böylece ideal durumda, sadece bir bileşenli saf bölgeler oluşur. Ücret ve hareketliliğe dayalı bir ayrım var. Nötr moleküller, elektroozmotik akış tarafından katoda çekilir, ancak ayrılamaz.

Misel elektrokinetik kromatografinin (MEKC) piyasaya sürülmesiyle, nötr moleküller de ayrılabilir. MEKC durumunda , elektrolite sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi deterjanlar eklenerek miseller oluşturulur . Bu, nötr moleküllerin miseller arasındaki dağılımlarına göre ayrılmasıyla sonuçlanır.

Ek olarak, kapiler jel elektroforezi (CGE) ve izoelektrik odaklama (CIEF) gibi yöntemler geliştirilmiştir. Kılcal jel elektroforezinde kılcal, bir polimerik jel ile, ör. B. poliakrilamid dolu. Bu aynı zamanda ayırmayı iyileştirmek için moleküler elek etkilerinden de yararlanır.

İle izoelektrik odaklama , amfoterik numune bileşenleri pH gradyanı boyunca ayrılır. Örneğin, amfoterik bileşikler olarak amino asitler yalnızca izoelektrik noktalarına ulaşılana kadar göç ettikleri için, yani dışa doğru nötr oldukları için bir ayrılma meydana gelir .

Bir başka olası uygulama izotakoforezdir (ITP). Kurşun ve uç elektrolitten oluşan süreksiz bir tampon sistemi kullanılır. Destekleyici elektrolit (en yüksek hareketlilik) ve bitiş elektrolit (en düşük hareketlilik) farklılık mobilitesi beri bir potansiyel bir sabit akım gözlemlerken uygulandığında degrade oluşturulan Ohm kanunu .

Edebiyat

  • Petr Jandik, Günther Bonn : Küçük Moleküllerin ve İyonların Kapiler Elektroforezi. VCH, New York NY ve diğerleri 1993, ISBN 1-56081-533-7 .
  • Patrick Camilleri (Ed.): Kapiler Elektroforez. Teori ve pratik. 2. Baskı. CRC Press, Boca Raton FL ve diğerleri 1998, ISBN 0-8493-9127-X .

İnternet linkleri