Boyut dışlama kromatografisi
Boyut dışlama kromatografisi (ayrıca jel geçirgenlik kromatografisi , GPC) bir tür sıvı kromatografisi olan moleküller , boyutlarından dolayı çözünmüş maddelerin (daha doğrusu, hidrodinamik hacmi ) ayrılabilir. Diğer isimler, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve fiziksel bir bakış açısından yanlış olarak, jel filtrasyon kromatografisi (GFC) veya moleküler elek kromatografisidir .
prensip
Ayırma etkisi, bir süzme işlemine değil , farklı boyutlardaki moleküller için farklı mevcut difüzyon hacimlerine dayanmaktadır. Gözenekli polimerleri durağan faz daha küçük moleküller, karşılık kendilerine sunulan difüzyon hacmini artırır ve böylece uzanan, nüfuz etmesini sağlar alıkoyma süresi . Bu nedenle küçük moleküller, yalnızca polimer granülat arasındaki boşlukların erişilebildiği büyük moleküllerden daha güçlü bir şekilde tutulur. Bu nedenle daha büyük moleküller kromatografi kolonundan daha hızlı akar . Bu nedenle, büyük moleküller elüatın erken fraksiyonlarında bulunurken daha küçük moleküller daha sonra elüe olur. Farklı boyutlarda moleküllere sahip bir numune artık ayrıştırılır. Çok büyük ve çok küçük moleküller birbirinden ayrılamaz. Gözenekler içine değil tüm moleküller uygun elütün başlayan çok az ve tüm çok iyi uyum moleküller en sonunda gözenekleri. Bu, yöntemi daha büyük molekülleri izole etmek için nispeten hızlı bir süreç haline getirir.
Durağan faz
Kural olarak, sabit faz olarak toz halindeki gözenekli polimerler kullanılır. Çapraz bağlı dekstranın ayırma özellikleri 1957'de Jerker Porath tarafından keşfedildi . Ayırma kolonu edilir dolu bir toz halinde parçacıklar ile hidrofilik , gözenekli ve çapraz bağlanmış bir madde; B. ile epiklorohidrin çapraz bağlı dekstran ( Sephadex bir çapraz bağlanmamış ya da birlikte), 2,3-dibromopropanol -crosslinked agaroz ( Sefaroz veya Sepharose CL ), dekstran metilenbisakrilamid kopolimeri ( Sephacryl ), bir metakrilat - etilen glikol - kopolimer ( Toyopearl ) veya Silika jel ve diğer silikatlar. Partiküllerin çapı yaklaşık 3-35 µm aralığındadır. Bu opak jelin partikülleri, oldukça gözenekli bir yüzeye sahiptir ve ayrılacak moleküllerin boyutuna bağlı olarak, yaklaşık 60-2000 Â arasında değişen gözenek boyutları ; (6-200 nm).
Molar kütleleri 5 ile 150 kDa arasında olan molekülleri ayırmak için ortalama gözenek boyutları 12,5 nm civarındayken, 10 ile 500 kDa arasındaki moleküller için yaklaşık 25 nm ve 20 ile 10.000 arasındaki moleküller için 45 nm gözenek boyutları kullanılır. kDa.
Ayırma sütunları
İki tip kolon arasında genel bir ayrım yapılır: sözde tek gözenekli kolonlar ve karışık yataklı kolonlar olarak da adlandırılan lineer kolonlar . Tek gözenekli kolonlar, çok küçük gözenek boyutu dağılımına sahip gözeneklere sahiptir. Belli bir boyut aralığında çok iyi ayrılırlar. Daha büyük bir molar kütle aralığında ayırma elde etmek için, farklı gözenek boyutlarına sahip üç ila dört ayırma kolonu genellikle seri olarak bağlanır. Karışık yataklı kolonlarda, kolon malzemesi üretici tarafından zaten karıştırılmıştır, böylece çok küçükten büyük gözeneklere kadar tüm gözenek boyutları temsil edilir. Bu kolonlar geniş bir molar kütle aralığında ve hidrodinamik hacimle çok lineer olarak ayrılır . Karışık yataklı bir kolonun ayırma performansı bu nedenle sınırlıdır, böylece burada da iyi bir ayırma için iki ila üç ayırma kolonu seri olarak birleştirilir. Günümüzde karma yataklı sütunlar hakimdir. Ancak, tek gözenekli kolonların özel uygulamalar için gerekçeleri vardır.
Bir GPC makinesinin yapımı
Otomatik bir GPC sisteminin temel bileşenleri pompa, enjeksiyon sistemi, ayırma kolonları ve çeşitli dedektörlerdir. Pompa solventi çeker ve tüm sistem boyunca sabit bir akış oluşturur. Çözücü genellikle , çözünmüş gazları uzaklaştıran bir hat içi gaz gidericiden emilir. Pompadan sonra, numune uygulaması için manuel veya otomatik numune alma için enjeksiyon sistemi bulunmaktadır. Aşağıdaki ayırma sütununda, numune hidrodinamik yarıçapına göre ayrılır. Farklı dedektörler daha sonra türe bağlı olarak belirli bilgiler verir. Sonuç olarak, tüm nehir (numune dahil) bir atık konteynerinde sona erer. Akış (elüat), fraksiyonasyon (hazırlayıcı GPC) olarak adlandırılan ayrı kaplarda da toplanabilir.
dedektörler
Farklı algılama varyantları ( kırılma indisi , UV / VIS aralığındaki ışık, viskozite, ışık saçılması, elektriksel iletkenlik, radyoaktivite ...) ilgili polimer tipine göre dikkatlice kalibre edilmelidir. Dedektör olarak kırılma indeksi dedektörleri ( RI dedektörü ) ve UV dedektörleri ( analiz edilecek polimerin UV aktivitesine bağlı olarak ) gibi konsantrasyon dedektörleri kullanılmaktadır. Bu dedektörler ile pik alanı konsantrasyonla orantılı olarak artar, bu da bir maddenin nicel olarak belirlenmesini sağlar. Klasik GPC ile sadece bu tip dedektör kullanılır ve sistem moleküler kütleyi belirlemek için standart maddelerle kalibre edilir.
Molar kütleye duyarlı dedektörler eş anlamlısı altında kullanılan viskozite dedektörlerini ve ışık saçılım dedektörlerini bulmaya devam etmektedir . Molar kütleyi hesaplamak için her durumda konsantrasyon gerekli olduğundan, bu tip dedektör sadece konsantrasyon dedektörleri ile birlikte kullanılabilir. Özel olarak, ışık saçılması olabilir , doğrudan tespit molekül ağırlıklı ortalama değerleri (M n , E w E, z ) ve dönme yarıçapı , bağımsız bir şekilde polimer standartları . Burada öncelikle çok açılı ( MALS ), küçük açılı ( LALS ) ve dik açılı ışık saçılım dedektörleri ( RALS ) arasında bir ayrım yapılır . Viskozite dedektörü ile Mark-Houwink denkleminin K ve α parametreleri , evrensel bir kalibrasyon ve polimerin konformasyonuyla ilgili açıklamalar yapılabilmektedir.
Kızılötesi dedektörler ve floresan dedektörler de kullanılır , ancak bunlar özel uygulamalarla sınırlıdır.
geleneksel kalibrasyon
Konvansiyonel kalibrasyon yalnızca bir konsantrasyon dedektörü (RI veya UV) kullanıldığında kullanılır. Kalibrasyon için genellikle düşük polidispersitelere sahip farklı boyutlarda birkaç polimer standardı kullanılır. Standartların belirtilen moleküler ağırlıklarından ve analiz sonrası elde edilen alıkonma süresinden kalibrasyon eğrisi oluşturulabilir. Bilinmeyen numunelerin moleküler kütlesi artık kalibrasyon eğrisi yardımıyla belirlenebilir. Sonuç, standart maddeye dayalı nispi molar kütlelerdir. Her polimer için dar dağılımlı standartlar mevcut olmadığından, farklı standartlar kullanıldığında moleküler ağırlık hesaplaması sorunlu olabilir. Bu gibi durumlarda mümkün olduğunca "benzer" standartlar kullanılsa da, molar kütle hesaplaması gerçek olandan önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Burada çok daha güvenli bir yöntem, aşağıdaki gibi doğrudan bir yöntem kullanmak olacaktır. B. ışık saçılması.
Evrensel kalibrasyon
Bir viskozite dedektörü ile birlikte bir konsantrasyon dedektörü (RI veya UV) kullanan GPC. İçin kalibrasyon polimer standartları düşük dağılımına sahip kullanılır, ve bir kalibrasyon eğrisi olan günlük (intrinsik viskozite moleküler ağırlığı x) ayarlayın. (Molar kütle x içsel viskozite) çarpımı hidrodinamik yarıçapla orantılı olduğundan, gerçek veya mutlak molar kütleler bu şekilde hesaplanabilir.
Işık saçılımı algılama
Bir ışık saçılım detektörü kullanarak, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmaya gerek yoktur. Bir ışık saçılım detektörü, mutlak moleküler kütleyi dolaylı olarak ölçer. Değerlendirme için bir konsantrasyon detektörü de gereklidir. Kurulan denklem ile John William Strutt, 3 Baron Rayleigh adlandırılan Rayleigh oranı R (θ), polimer konsantrasyonu, c ve ağırlık ortalama moleküler ağırlığı Mw olarak ifade edilir dağınık ışık yoğunluğu arasındaki ilişkiyi tarif eder ağırlık . Burada K bir optik sabittir ve bir 2'dir ikinci viral katsayısı.
Moleküler ağırlık tayini
Molar kütlesi bilinmeyen bir molekülün alıkonma süresi veya elüsyon hacmi ile bilinen molar kütleye sahip moleküllerin alıkonma süreleri veya elüsyon hacimleri ( comigration standardı ) karşılaştırılarak, oluşturulan grafikle karşılaştırma veya kullanılarak hesaplama yoluyla bir molar kütle belirlenebilir . bir regresyon analizi . Proteinler söz konusu olduğunda, molar kütlenin belirlenmesi, yalnızca benzer protein kıvrımlarına sahip proteinler için yararlıdır (yani, küresel proteinleri birbirleriyle veya fibriler proteinleri birbirleriyle karşılaştırarak), çünkü moleküllerin şekli göç hızını etkiler. Bu nedenle proteinler söz konusu olduğunda, molar kütlenin SDS-PAGE veya kütle spektrometrisi denatüre edilerek belirlenmesi daha olasıdır .
Uygulamalar
Tipik uygulama, sentetik polimerler veya biyopolimerler (örn. polisakaritler , DNA , RNA ve proteinler ) gibi her türlü makromolekülün ayrılmasıdır ( polimer fraksiyonasyonu ). Uygun kalibrasyon sonra mol kütle dağılımı eğrisi olup elde edilen elüsyon gelen eğri farklı ağırlıklı ortalama mol kütleleri (M hangi, n , E w ...) ve polidispersite numunesi daha sonra hesaplanabilir. Makromolekül ayrımı alanında , alan akışı fraksiyonasyonu (FFF), alternatif bir yöntem olarak giderek daha fazla yerleşmiştir.
kesinlik
Sentetik polimerlerin jel geçirgenlik kromatografisi için halka testi mevcuttur. Bir organik faz ve klasik detektörleri (RI, UV), bağıl varsayarsak , standart sapması s arasında R, rel ağırlık ortalama M w yaklaşık% 8 ila 10. Ölçülen değişkeni tanımlanmış bir dizi referans maddeye bağlayarak önemli ölçüde azaltılabilir. Biraz daha yüksek in R rel değerleri sonuç sayısal ortalama için E n . Burada temel hattın nasıl oluşturulacağına kesin olarak karar verilmesi önemlidir. s R , standart ölçüm belirsizliği u için iyi bir tahmindir .
Alternatif yöntemler
Özellikle makromoleküller, nanopartiküller ve aglomerasyon ile, durağan faz ile etkileşimin bir sonucu olarak jel permeasyon kromatografisinde problemler sıklıkla ortaya çıkar. Kolonun tıkanması, aglomeraların emilmesi ve kolondaki kesme kuvvetleri nedeniyle moleküllerin bozunması sıklıkla tanımlanan problemlerdir. Açık akış kanalında statik bir faz olmaksızın ayrılma nedeniyle , alan akışı fraksiyonasyonunda (FFF) bu etkilerden kaçınılır.
Edebiyat
- Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Biyoanalitik . Spektrum Akademik Yayınevi, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413 .
- Hubert Rehm, Thomas Letzel: Deneyci : Protein Biyokimyası / Proteomik . 6. baskı, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3827423122 .
İnternet linkleri
Bireysel kanıt
- ↑ Jerker Porath , Per Flodin: Jel filtrasyonu: tuzdan arındırma ve grup ayırma yöntemi. In: Nature (1959), Cilt 183 (4676), sayfa 1657-9. PMID 13666849 .
- ↑ J. Porath: Proteinlerin, peptitlerin ve amino asitlerin jel filtrasyonu. In: Biochim Biophys Açta (1960), Cilt 39, sayfa 193-207. PMID 14434211 .
- ^ P. Andrews: Sephadex jel filtrasyonu ile proteinlerin moleküler ağırlıklarının tahmini. In: Biochem J. (1964), Cilt 91 (2), sayfa 222-33. PMID 4158310 ; PMC 1202876 (ücretsiz tam metin).
- ^ J. Porath: Jel filtrasyonundan adsorptif boyutu dışlamaya. İn: . J Protein Chem (1997), Cilt 16 (5), sayfa 463-8... PMID 9246630 .
- ↑ Bruno Wampfler, Samuel Affolter, Axel Ritter, Manfred Schmid: Plastik analizinde ölçüm belirsizliği - yuvarlak robin test verileriyle belirleme . Hanser, Münih 2017, ISBN 978-3-446-45286-2 , s. 78-83 .